1.1復(fù)色光對(duì)比耳定律的偏離

比耳定律成立的前提條件是人射光是單色光，但是精度再高的儀器，即使是雙單色器的分光光度計(jì)，也只能獲得近乎單色的光，無(wú)法獲得純單色光，它仍然含有狹窄光通帶，具有復(fù)色光的性質(zhì)。而復(fù)色光會(huì)導(dǎo)致比耳定律的正或負(fù)偏離。

固定狹縫的紫外分光光度計(jì)光譜帶寬一般為1nm或2nm，可調(diào)狹縫的可以做到0.Inm；可見(jiàn)分光光度計(jì)帶寬6nm、snm，甚至十幾納米。

光譜帶寬應(yīng)該是越小越好，但是隨著光譜分辨率的提高，儀器的靈敏度降低，所以選擇儀器時(shí)要綜合考慮各種條件的影響。當(dāng)溶液濃度較小且單色光較純時(shí)，可近似認(rèn)為符合比耳定律。

1.2雜散光的影響

雜散光是指進(jìn)人檢測(cè)器的處于待測(cè)波長(zhǎng)光譜帶寬范圍外的其他波長(zhǎng)組分，它是光譜測(cè)量中誤差的主要來(lái)源。

產(chǎn)生原因有:分光光度計(jì)的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計(jì)工作波段邊緣波長(zhǎng)處，由于單色器透光率、光源輻射強(qiáng)度、檢測(cè)器靈敏度都較低，雜散光的影響更為顯著。

雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴(yán)重的測(cè)量誤差，實(shí)際工作中，在定量分析時(shí)，一般在吸收峰或其附近處測(cè)量樣品吸光度，如果在分析波長(zhǎng)處含有雜散光，這時(shí)樣品的透光率較小，而雜散光大部分透過(guò)，使測(cè)量吸光度低于真實(shí)吸光度。

1.3儀器噪聲對(duì)測(cè)t的影響

儀器噪聲也是儀器的一個(gè)重要指標(biāo)，它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測(cè)量的分析信號(hào)中的不需要的信號(hào)，掃描100%T和0%T線(xiàn)，可觀察到分光光度計(jì)的噪聲水平，如果儀器噪聲較大，會(huì)掩蓋較小的測(cè)量信號(hào)，一般用噪音的二倍來(lái)表示儀器的靈敏度。

1.4波長(zhǎng)和吸光度準(zhǔn)確度

樣品的每一個(gè)值都是在一定的波長(zhǎng)下測(cè)得的，如果波長(zhǎng)誤差很大，測(cè)出的值肯定不準(zhǔn)。吸光度準(zhǔn)確度也是用戶(hù)對(duì)儀器的直接要求，更應(yīng)引起足夠的重視。

國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)透射比準(zhǔn)確度為*士0.6%， B級(jí)土1.0%。

2測(cè)量條件的選擇

2.1參比溶液和溶荊的選擇

分光光度計(jì)的測(cè)量實(shí)際上是以通過(guò)參比池的光強(qiáng)度作為人射光強(qiáng)度來(lái)測(cè)定試樣的吸光度，先調(diào)節(jié)儀器使透過(guò)參比池溶液的吸光度為零，然后讓同一束光通過(guò)樣品，使得吸光度比較真實(shí)地反映待測(cè)物質(zhì)的濃度，所以參比溶液的選擇非常重要。

如果僅有待測(cè)物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收，可用純?nèi)軇┗蛘麴s水作參比溶液。如果顯色劑有顏色，并在測(cè)定波長(zhǎng)下有吸收，則用顯色劑溶液作參比溶液，所加人顯色劑及其它試劑的量，與試樣中的加入量應(yīng)一致。

如果樣品中其它組分本身的顏色對(duì)測(cè)定有干擾，而所用顯色劑沒(méi)顏色，則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。

正確選擇合適的溶劑，對(duì)提高分析的準(zhǔn)確度起重要作用。為減小溶劑中雜質(zhì)的影響，應(yīng)選擇高純度的溶劑；溶劑應(yīng)不與待測(cè)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；待測(cè)物在溶劑中要有一定的溶解度；在測(cè)定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，溶劑本身沒(méi)有吸收，注意常用溶劑的zui短可用波長(zhǎng)；當(dāng)用揮發(fā)性大的溶劑時(shí)，測(cè)量過(guò)程中吸收池應(yīng)加蓋。

2.2測(cè)試波長(zhǎng)的選擇

當(dāng)用分光光度計(jì)對(duì)溶液進(jìn)行測(cè)定時(shí)，首先需要選擇合適的測(cè)量波長(zhǎng)。選擇的依據(jù)是該被測(cè)溶液的吸收曲線(xiàn)。在一般情況下，我們總是選擇zui大吸收波長(zhǎng)作為測(cè)量波長(zhǎng)，這樣可以提高靈敏度。

而在有些情況下zui大吸收峰很尖銳、吸收過(guò)大或附近有干擾存在，就不能選zui大吸收波長(zhǎng)，而必須在保證有一定靈敏度的情況下，選擇吸收曲線(xiàn)中的其它波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定(曲線(xiàn)較平坦處對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng))，以消除干擾。繪制吸收曲線(xiàn)是正確選擇波長(zhǎng)的有效手段和方法。

3、分光光度計(jì)的檢驗(yàn)小妙招

波長(zhǎng)準(zhǔn)確度的檢驗(yàn)

分光光度計(jì)在使用過(guò)程中，由于機(jī)械振動(dòng)、溫度變化、燈絲變形、燈座松動(dòng)或更換燈泡等原因，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)刻度盤(pán)上的讀數(shù)與實(shí)際通過(guò)溶液的波長(zhǎng)不符合的現(xiàn)象，因而導(dǎo)致儀器靈明度降低，影響測(cè)定結(jié)果的精度，需要進(jìn)行檢驗(yàn)。

檢驗(yàn)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度zui簡(jiǎn)單的方法是用干涉濾光片或鐠釹濾光片測(cè)量?jī)x器的吸收峰值, 如果測(cè)出的值與濾光片標(biāo)準(zhǔn)值之差超出規(guī)程規(guī)定, 則需要進(jìn)行波長(zhǎng)調(diào)節(jié)。

透射比正確度的檢驗(yàn)

用透射比標(biāo)準(zhǔn)值分別為10 %、20 %、30 %左右的光譜中性濾光片，可見(jiàn)光區(qū)分別在440、546、635nm波長(zhǎng)處，以空氣為參比，分別測(cè)量各濾光片的透射比，紫外光區(qū)用重鉻酸鉀溶液分別在235、257、313、350nm波長(zhǎng)處，以高氯酸溶液為參比，測(cè)量其透射比。

穩(wěn)定度的檢驗(yàn)

在零點(diǎn)不受光的條件下，用零點(diǎn)調(diào)節(jié)器將儀器調(diào)至零點(diǎn)，觀察3分鐘讀取透射比的變化，即為零點(diǎn)穩(wěn)定性。在儀器測(cè)量范圍兩端向中間靠10nm處，調(diào)節(jié)零點(diǎn)后，蓋上樣品室蓋(打開(kāi)光門(mén))，使光電管受光，調(diào)節(jié)透射比為95%（數(shù)顯儀器調(diào)至100%）察3分鐘讀取透射比的變化，為光電流穩(wěn)定性。 

光的檢驗(yàn)

可見(jiàn)分光計(jì)棱鏡式儀器在420nm處，光柵式儀器在360nm處，紫外分光計(jì)在220nm處分別用符合規(guī)定的截止濾光片，以空氣為參比，測(cè)量其透射比值，即為儀器在相應(yīng)波長(zhǎng)下的雜散輻射率。